Ideea unui muzeu în oraşul nostru a apărut pentru prima oară în 1868, când Ministerul Instrucţiunii Publice a împărtăşit sugestia lansată în acest sens de August Treboniu Laurian, întors dintr-o călătorie arheologică la Drobeta. Dimitrescu, în 1881, a fost amenajat primul spaţiu destinat unei expoziţii muzeale, în clădirea primăriei severinene, sub egida Societăţii de Istorie şi Arheologie. Adevărata naştere a muzeului s-a produs însă în 1912, graţie lui Alexandru Bărcăcilă, care a dat instituţiei o perspectivă regională, ce îngloba, sub aspect istoric, geografic şi etnografic, zona Mehedinţiului şi a clisurii Dunării. După 1912, timp de aproape un deceniu şi jumătate, muzeul a funcţionat la Liceul Traian, colecţiile sale fiind constituite şi îmbogăţite prin săpăturile şi cercetările lui Alexandru Bărcăcilă la Castrul Drobeta şi Cetatea Severinului. Preocupat de soarta acestor colecţii mereu în creştere, dar în acelaşi timp de sănătatea elevilor interni de la Liceul Traian, imediat după încheierea primului război mondial, Alexandru Bărcăcilă s-a ocupat de ridicarea unei clădiri destinate exclusiv muzeului şi internatului. Muzeul a fost pus sub supravegherea Comisiei Monumentelor Istorice, iar lui Alexandru Bărcăcilă i s-a încredinţat conducerea instituţiei. Pe lângă secţia de arheologie-istorie deja existentă, în 1927, Alexandru Bărcăcilă a înfiinţat secţia de ştiinţele naturii, bazată pe colecţia donată de prof. Lacriţeanu. În 1933, muzeul era organizat pe trei secţii (arheologie preistorică, romană şi medievală; etnografie şi istoria românilor; ştiinţele naturii cu flora, fauna şi mineralogia regiunii) şi îşi propunea „să înfăţişeze natura şi omul în evoluţia lor în limita regiunii Porţilor de Fier”, adică a judeţului Mehedinţi, Banatului răsăritean şi văii Timocului din Serbia cu populaţia sa compact românească. În timpul celui de-al doilea război mondial şi în anii următori, spaţii ale muzeului au fost alocate şcolilor cu imobilele distruse de bombardamente. După 1960, aceste spaţii i-au fost redate treptat. Între anii 1950-1951, Muzeul Dr. C. Istrati, inaugurat la 30 noiembrie 1924, a fuzionat cu Muzeul „Porţile de Fier”, patrimoniul primului intrând în componenţa colecţiilor Muzeului „Porţile de Fier”. La începutul anilor ’70, în contextul lucrărilor Sistemului Hidroenergetic şi de Navigaţie de la Porţile de Fier, a avut loc reamenajarea instituţiei pe baze muzeotehnice moderne. Inaugurarea expoziţiilor cu faţa radical înnoită a avut loc la 15 mai 1972. În noua structură funcţională a muzeului au intrat secţiile istorie-arheologie şi ştiinţele naturii-acvariu, cărora li s-au adăugat ulterior secţia de artă contemporană (amenajată între anii 1975-1976 în casa Sabetay, tranformată pentru un deceniu în casă prezidenţială şi redată circuitului muzeistic după 1990), apoi secţia de etnografie (finalizată în primăvara anului 1982) şi laboratorul de conservare, apoi secţia relaţii publice, marketing cultural şi pedagogie muzeală. În România, este singurul muzeu amplasat într-un adevărat parc arheologic (circa 5 ha), în aria căruia se află ruinele castrului Drobeta, podului lui Traian, thermelor romane, amfiteatrului roman, fortificaţiei poligonale feudale şi ale bisericii medievale.
